Minute(TM)细胞膜蛋白分离试剂盒(50次)|Invent|上海金畔生物科技有限公司

Minute(TM)细胞膜蛋白分离试剂盒(50次)

货号:SM-005
包装:50 PREPS

  • 英文名:MINUTE(TM) PLASMA MEMBRANE PROTEIN ISOLATION AND CELL FRACTIONATION KIT (50 PREPS)
  • 品牌:Invent
  • 植物膜蛋白占植物细胞总蛋白的很小一部分,但是在植物生理学中起着非常重要的作用。传统的植物膜蛋白分离纯化方法是蔗糖密度梯度离心法和双液相法。这些方法虽然比较有效,但是需要超高速离心和大量的起始原材料,操作过十分繁琐和费时。为了克服植物膜蛋白提取中的缺点,Invent特别开发了此款植物膜蛋白提取试剂盒【SM-005】。
    产品详情

     

    Minute(TM)细胞膜蛋白分离试剂盒(50次)|Invent|上海金畔生物科技有限公司

    细胞膜蛋白占细胞总蛋白的很小一部分,但是在物生理学中起着非常重要的作用。传统的细胞膜蛋白分离纯化方法是蔗糖密度梯度离心法和双液相法。这些方法虽然比较有效,但是需要超高速离心和大量的起始原材料,操作过十分繁琐和费时。为了克服植物膜蛋白提取中的缺点,Invent特别开发了此款Minute(TM)细胞膜蛋白分离试剂盒(50次)

     

    细胞组织首先通过缓冲液 A 中致敏,匀浆,然后通过一个特殊的离心管柱,在此过程中匀浆的组织通过柱子特有的 之字形通路后细胞膜被切割成大小相等的碎片,后续无需超高速离心,通过差速离心法和密度梯度离心法将天然的质膜蛋白从未破裂的细胞,细胞核,细胞质和细胞器的混合物中分离出来。在每次实验中仅需使用相同量的起始材料,离心力和离心时间,即可高度富集膜蛋白,并保证一致性良好。整个操作过程大约 小时可以完成。

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    图1.A.人和大鼠培养细胞中总细胞溶解物(TC)和分离质膜蛋白(PM)的SDS-PAGE图谱。道1,人肺癌细胞A549总细胞溶解液;道2,A549的分离PM;道3,大鼠rel-6tn细胞的PM;道4,大鼠rel-6tn细胞的总细胞溶解液。
    B.蛋白质印迹法:将A中的蛋白质转移到硝化纤维素膜上,用质膜标记物anti-na/k-atpase-alpha1(克隆抗体,克隆号464.6)和核包膜标记物anti-lamin-b1(AB16048,abcam,剑桥市,马塞诸塞州)进行探测。用色度基质opti-4cn(bio-rad)观察特异性蛋白带。
    C.比重法测定B中Na/K ATP酶 alpha1信号(TC与PM)。用Minute变性总蛋白提取试剂盒(SD-001,invent生物技术,伊登普雷里市,明尼苏达州)提取总细胞溶解物。

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    图2 A.从小鼠组织分离的总膜蛋白的SDS-PAGE条带图(T=总细胞溶解物,C=胞质溶胶分数,M=总膜分数)
    B.将A中蛋白质转移到硝化纤维素膜上,用兔抗鼠泛钙粘蛋白(ab6529,abcam,剑桥市,马塞诸塞州)和抗肌动蛋白通过蛋白质印迹法进行探测。用色度基质opti-4cn(bio-rad)观察特异性蛋白带。在总膜蛋白组分中,pan-cadherin(一种130kDa的质膜标记物)的信号显著增强。通过Minute™变性总蛋白提取试剂盒(SD-001,invent生物技术,伊登普雷里市,明尼苏达州)提取总细胞溶解物。

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    图3. A.小鼠组织总膜蛋白(TM)和分离质膜蛋白SDS-PAGE条带图。
    B.将A蛋白试用蛋白质印迹转移到硝酸纤维素膜上,用兔抗钙粘蛋白(Abcam,剑桥市,马塞诸塞州)进行检测。用色度基质opti-4cn(bio-rad)观察特异性蛋白带。

    c.比重法测定B中钙粘蛋白信号(TM与PM)。

    应用

    试剂盒用于快速从植物组织中分离天然膜蛋白,可应用于 SDS-PAGEimmunoblottingsELISAIP膜蛋白质结构分析2-D酶活性测定及其他应用。

    储存

    -20℃储存

     

    特点

     

     

    • 简单,快速,性价比高

    • 天然细胞组份分离(细胞质,细胞器和质膜)

    • 真正未变性的膜蛋白—无表面活性剂及EDTA

    • 100%保留蛋白活性及蛋白间相互作用

    • 小样品量


     

    试剂盒组份(50次)

    1. 25 ml 裂解液 A

    2. 10 ml 裂解液 B

    3. 50 个离心管柱

    4. 50 个收集管

    5. 4 根塑料研磨棒

    6. 组织分离粉

    所需附加材料

     

    1. 1XPBS

    2. 涡旋震荡仪

    3. 台式离心机

     

    重要产品信息

    1. 仔细阅读整个操作说明。将缓冲液 A 和缓冲液 B 完全解冻后摇匀,放置于冰上。将离心管柱和接收管套管放置于冰上预冷。

    2. 所有离心步骤都需要在 4℃室温下或者低温离心机中进行。

    3. 研究蛋白磷酸化,磷酸酶抑制剂应在使用前加入缓冲液 A 中。蛋白酶抑制剂可以选择添加或不添加。

    4. 推荐使用 BCA 试剂盒用于蛋白浓度测定

       


    膜蛋白分离步骤

    1. 将离心管柱及接收管套管放置冰上预冷

    2. A. 大 部 分 较 软 的 植 物 组 织 样 品 , 将 新 鲜 组 织 或 冷 冻 组 织 ( 200-300mg ) 切成小片(1-2mmX1-2mm),放入离心管柱套管上,用 1ml 吸头反复挤压组织减少体积,称取 50-80mg组织分离粉加入离心管柱中,用塑料棒反复扭转研磨组织 1-2 分钟。加入 100ul Buffer A 至离心管柱中,然后继续研磨几分钟,加 A 至满为止,开盖冰上孵育 5 分钟。接转步骤 3。
      B.含水量较多的组织样品(例如水果组织),将大约 300mg 组织样品剪切成小块放入离心管柱中,台式离心机最高速离心 1 分钟去除多余水分,然后按照上一条描述方法匀浆,匀浆后冰上孵育 5 分钟,接转步骤 3。
      C.较难研磨的组织样品(例如根和水稻叶片),匀浆步骤可在离心管柱外用研钵或同类匀浆设备进行操作。匀浆后,加入适量的 Buffer A(大约 300-400ul),冰上孵育 5 分钟,将匀浆好的样品转移到离心管柱中,然后接转步骤 3。

    3. 盖上盖子,14000rpm(16,000Xg)离心 30 秒。(需要最短时间达到设定转速)

    4. 弃去离心管柱,涡旋大力震荡 10-20 秒重悬沉淀。以下步骤将植物组织匀浆分为四个组分:细胞核细胞质细胞器质膜

    5. 3000rpm(700Xg)离心 1 分钟(沉淀包括完整的细胞核和大的碎片)。

    6. 将上清转移到新的 1.5ml 离心管中,4℃,16000Xg 离心 30 分钟(延长离心时间可以增加产量)。弃去上清(上清为胞浆组份),保存沉淀(沉淀为总膜蛋白组份包括细胞器和质膜)。如果不需要分离质膜做到此步骤即可,将总膜组份存储于-80℃。如果需要分离质膜,请不要冷冻总膜组份,继续第 7 步骤。

    7. 加入 200ul Buffer B 用吸头反复吹打或涡旋震荡重悬第 6 步的总膜蛋白组份。4℃,10000rpm(7800Xg)离心 5 分钟(注意:如果最终质膜组份中含有细胞器膜污染,此步骤离心时间可增加到 20 分钟提高纯度)。沉淀部分为细胞器.

    8. 第 7 步离心后,小心的将上清液转移到新的 2.0ml 离心管中,加入 1.6ml 预冷的 PBS,盖上盖子混匀几次。14000rpm(16000Xg)离心 30 分钟(延长离心时间可以增加产量)。弃去上清液,保存沉淀(沉淀为质膜蛋白)。产量一般为 10-100ug。质膜蛋白可以根据下游实验需求用 20-200ul 含表面活剂的缓冲液溶解。推荐使用下表中 MinuteTM 系列溶解液溶解膜蛋白。做等电聚焦(2D 凝胶第一维)我们建议使用:7M 尿素/2M 硫脲/2%Chaps 和 20mM DTT (使用前将 DTT 加入以上混合液中)。

       

    Minute(TM)细胞膜蛋白分离试剂盒(50次)|Invent|上海金畔生物科技有限公司

    说明书中 rpm 根据 Eppendoff 5415C 台式离心机换算

     

    推荐按照下游实验应用选择以下蛋白溶解液溶解膜蛋白

     

    常见问题

     

     

     

    英文特生物技术股份有限公司(Invent Biotechnologies, Inc.)于2010年成立于美国明尼苏达州的Eden Prairie市。作为全球应用离心管柱滤器提取蛋白及亚细胞结构的先驱,英文特生物技术股份有限公司已成功开发出二十多个具有独家知识产权的创新产品,其中不乏全球独有的特色产品,所有产品均具有超快速,易用,高产及重复性强的特性。金畔生物专业提供Invent品牌膜蛋白分离相关试剂产品。金畔生物专业客户团队热心为您服务!